Responsable Científico: Pablo González-Melendi de León

pablo.melendi@upm.es 910679169 / 910679107 ( Lab Microscopía )

 

Personal:

Personal técnico: Alonso Ramos, Paula - Técnico/a


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Charter of services


actualmente, el servicio de microscopía del CBGP dispone de equipos para la inclusión y corte de muestras en parafina, vibratomo así como estereomicroscopios y microscopios de fluorescencia equipados con cámaras CCD y dos microscopios confocales. El equipamiento se somete a una renovación periódica con objeto de incluir la tecnología más puntera. Casi todo el equipamiento se encuentra en la ubicación principal del laboratorio, aunque por cuestiones de espacio algunos equipos están en otras salas del CBGP.

 

Más específicamente, el laboratorio de microscopía del CBGP cuenta con el siguiente equipamiento


  1. Microtomo de rotación Leica HistoCore NANOCUT R (planta sótano).
  2. Vibratomo Leica VT1200 S (planta sótano).
  3. Dispensador de parafina Leica EG 1110 (planta sótano).
  4. Horno de hibridación Amersham (planta sótano).
  5. Microscopio vertical con fluorescencia Zeiss Axiophot (con cámara) (planta sótano).
  6. Microscopio vertical con fluorescencia Leica DM2000 (con cámara) (primera planta).
  7. Microscopio vertical Nikon Labophot-2 (segunda planta).
  8. Estereomicroscopio Leica MZ10 F (con cámara) (planta sótano).
  9. Estereomicroscopio Leica M205FA (con cámara) (planta sótano).
  10. Estereomicroscopio Leica MZ95 (primera planta).
  11. Cámara CCD NightOwl LB 983 NC100 Berthold con luminiscencia (segunda planta).
  12. Luminómetro Varioskan lux (planta sótano).
  13. Microscopio espectral invertido Leica TCS SP8 (planta sótano).
  14. Microscopio espectral directo Zeiss LSM 880 (planta sótano).

Microscopio confocal invertido Leica TCS-SP8

Microscopio confocal vertical con superresolución Zeiss LSM 880 con fast Airyscan

 

En estas instalaciones se pueden realizar las siguientes técnicas


  1. Preparación y corte de bloques de parafina en microtomo y vibratomo.
  2. Microcopía de fluorescencia: Fluorescencia es un proceso de absorción de un fotón y posterior emisión de otro fotón de menor energía (longitud de onda más larga) por una molécula (fluoróforo). La epifluorescencia convencional combina una fuente de luz blanca potente con filtros y espejos ópticos para separar distintos haces de luz y para tener especificas longitudes de onda de excitación y detección para cada fluoróforo. Usando técnicas de marcaje podemos combinar diferentes fluoróforos para marcar estructuras celulares (tipos celulares) y subcelulares (membrana plasmática, núcleo, etc.).
  3. Microscopía confocal: El microscopio confocal es un microscopio que emplea una técnica óptica de imagen para incrementar el contraste y poder realizar finos cortes ópticos con la posibilidad de reconstrucción de imágenes tridimensionales. Estos equipos se utilizan principalmente tanto para las muestras marcadas con fluorescencia, como existe la posibilidad de utilizar la luz refractada: dientes, huesos, también son buenos candidatos para su uso con la técnica del microscopio confocal.
  4. Microscopía de campo claro: La microscopia de campo claro está basada en la transiluminación de muestras desde una fuente de luz blanca, enfocado por un condensador para traspasar la muestra hasta llegar a la lente del objetivo que recoge la luz para su visualización en los oculares o adquisición con una camera digital. Es una técnica útil para visualizar células, tejidos, cortes histológicos con marcaje colorimétrico, tanto en animales modelos (pez cebra, C. elegans) como en plantas modelo (Arabidopsis thaliana). Contraste de fases y de Nomarkski son modalidades de visualización de campo claro usando lentes y elementos ópticos específicos para mejorar el contraste de estructuras que de otras formas serían invisibles.
  5. Tinciones histoquímicas: Identificación de un constituyente de un tejido in situ mediante una reacción antígeno-anticuerpo específica visualizada con un marcador coloreado.
  6. Captación de imágenes de bioluminiscencia.

 

El personal del laboratorio de microscopía ofrece a los usuarios los siguientes servicios: entrenamiento en el uso del equipamiento del laboratorio, preparación de muestras, captación de imágenes. Además, realiza de forma rutinaria las labores de mantenimiento y limpieza de los equipos.

 

En estas instalaciones se pueden realizar los siguientes ensayos (entre otros)


  1. Análisis de diferenciación de tipos celulares en tejidos vegetales y animales.
  2. Detección de la presencia de patógenos y localización celular de los mismos.
  3. Optimización de sensores biológicos para la monitorización de procesos biológicos.
  4. Localización subcelular de proteínas.
  5. Marcaje de diferentes tipos celulares.
  6. Análisis anatómico de tejidos vegetales y animales.

 

Por tanto, se utilizan muestras vivas de microorganismos, y de tejidos/líneas celulares de plantas y de animales.
 
No se dispone de normas o procedimientos validados por organismos externos. Sin embargo, para utilizar los equipos del servicio por primera vez usuarios deben hacer un curso impartido por el personal del servicio (consultar fechas).
  

El programa Fiji para análisis y procesado de imágenes se puede descargar pinchando Aquí.

 


Microtome Leica HistoCore NANOCUT R
  1. Automatic or manual working mode.
  2. Ergonomic and independent control panel.
  3. Holders for paraffin-wax and resin embedded specimens.
  4. Holders for steel and diamond knifes.
  5. Minimum sectioning thickness 0,5 µm.
  6. Integrated stereomicroscope.

 

 

 

 

Vibratome Leica VT1200 S

  1. Thick sections from non-embedded specimens by blade (Guillete) vibration.
  2. Automatic or manual working mode.
  3. Ergonomic and independent control panel.
  4. Integrated stereomicroscope.

Paraffin-wax dispenser Leica EG 1110

Hybridisation oven Amersham

 

 

  • Fluorescence cubes:

Excitation light

Excitation filter

Dichroic mirror

Emission filter

UV

BP 365

395

LP 397

blue

450-490

510

LP 520

green

BP 546

580

LP 590

 

  • Objectives:

Type

Magnification/numerical aperture

Technique

Immersion

Plan-NEOFLUAR

2.5x/0.075

 

 

Plan-NEOFLUAR

5x/0.15

 

 

Plan-NEOFLUAR

10x/0.3

 

 

Plan-NEOFLUAR

20x/0.5

DIC*

 

Plan-NEOFLUAR

40x/0.75

DIC*

 

Plan-NEOFLUAR

40x/1.3

phase contrast

oil

Plan-NEOFLUAR

63x/1.25

 

oil

Plan-NEOFLUAR

100x/1.3

 

oil

 

*DIC = differential interference contrast

 

Coupled to colour CMOS camera DC.20000i euromex (20 Mpixels).

  • Objetives:

Type

Magnification/numerical aperture

Technique

Inmersion

E PLAN

10x/0.25

BF 

 

E PLAN

40x/0.65

BF

 

E PLAN

100x/1.25

BF

oil

 

  1. diascopic and episcopic illumination
  2. plan-apochromatic objective 1.0x/0.125
  3. zoom 0.8x – 8x
  4. fluorescence cubes

Type

Excitation light

Excitation filter

Dichroic mirror

UV

UV

360/40

420

GFP Plus

blue

460-500

510

GREEN

green

546/10

590

 
Coupled to colour CCD camera Leica DFC 400C (5 Mpixels).

 

  • Fluorescence cubes:

Type

Excitation light

Excitation filter

Dichroic mirror

Emission filter

A

UV

BP 340-380

400

LP 425

L5

blue

BP 480/40

505

BP 527/30

N2.1

green

BP 515-560

580

LP 590

 

  • Objectives:

Type

Magnification/numerical aperture

Technique

Immersion

C PLAN

10x/0.22

 

 

C PLAN

20x/0.4

phase contrast

 

C PLAN

40x/0.65

phase contrast

 

HI PLAN

63x/0.75

 

 

C PLAN

100x/1.25

 

oil

 
Coupled to colour CCD camera Leica DFC 300FX (1,4 Mpixels).
  1. episcopic illumination
  2. objectives 0.5x y 1.0x
  3. zoom 0.63x – 5.7x
  4. fluorescence cubes

 

Type

Excitation light

Excitation filter

Dichroic mirror

UV

UV

400-440

475

GFP

blue

460-490

510

  1. episcopic illumination
  2. objective PLAN 1.0x
  3. zoom 0.63x – 6x

 

Inverted microscope Leica DMI6000CS 

 

  1. touchscreen STP6000

  2. smart move (moves the stage in XY and Z) 

  3. metal halide bulb EL6000 (120 W)

  4. Fluorescence clubes:

Type

Excitation light

Excitation filter

Dichroic mirror

Emission filter

A4

UV

BP 360/40

400

BP 470/40

CFP

violet/blue

BP 436/20

455

BP 480/40

GFP

blue

BP 470/40

500

BP 525/50

I3

blue

BP 450-490

510

LP 515

N2.1

green

BP 515-560

580

LP 590

 

  • objectives:

Type

Magnification/numerical aperture

Technique*

Immersion

PL APO CS

10x/0.4

BF,FLUO

 

PL APO CS

20x/0.70

BF,FLUO

 

PL APO CS2

20X/0.75

BF,DIC,FLUO

water, glycerol, oil

PL APO CS2

40x/1.1

BF,DIC,FLUO

water

PL APO CS2

63x/1.4

BF,DIC,FLUO

oil

 

*BF = bright field, DIC = differential interference contrast, FLUO = fluorescence

 

Confocal module

 

FOV scanner: 
  1. speed up to 1.800 Hz (3.600 Hz in bidirectional mode)
  2. up to 7 fps @ 512 x 512 px
  3. image format up to 8.192 x 8.192 px
Lasers: 
  1. CW (405 nm). 50 mW
  2. Ar (458, 488 y 514 nm). 100 mW
  3. DPSS (561 nm). 20 mW
  4. He-Ne (633 nm). 10 mW
Detectors: 
  1. 4 spectral for fluorescence and reflection (2 PMT and 2 HyD)
  2. 1 (non-confocal) for transmitted light
LIAchroic beam splitter, which includes the dichroic mirrors: 
  1. substrate (405)
  2. 488/561/633
  3. 458/514/561
  4. 476/488
  5. RT 15/85 (reflection)
  6. 488/561
Galvanometric Z-stage: 
  1. min. step 20 nm
  2. range 1500 µm
Motorized XY scanning stage 
  1. speed: 10 mm/s
  2. resolution 0,02-0,04 µm
  3. reproducibility

Software 

LAS X with wizard for FRET & FRAP analysis and 3D viewer

 

Bioluminiscence, chemiluminiscence and fluorescence (GFP)
  1. resolution 1024 x 1024 px
  2. sensitivity 300 to 1050 nm
  3. quantum yield (QY) 90% @ 620 nm
  4. dynamic range 82 dB

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

  1. external control panel for motorized functions
  2. episcopic illumination by upright semirigid LED lamps
  3. transmitted light base with three types of illuminations: bright field, Rotermann contrast and dark field
  4. apochromat objective 1X: NA 0,17 y WD 61,5 mm
  5. apochromat objective 2X: NA 0,35 y WD 20,1 mm
  6. motorized zoom, magnification between 0,78X and 16X (20,5 range)
  7. motorized fluorescence route
  8. Fluorescence cubes:

 

Type

Excitation light

Excitation filter

Dichroic mirror

DAPI

UV

350/50

460/50

GFP

blue

470/40

525/50

mCherry

green

560/14

630/75

 

Features:

  • Electron Multiplying Back Thinned Transfer CCD technique
  • high frame rate format with 512 x 512 pixels of 16x16 μm
  • readout speed of the full image 70 fps
  • binning 1x1, 2x2 and 4x4
  • EM (electron multiplying) gain between 1 - 1200x
  • Quantum Yield (QY) > 90%
  • analog gain between 0,5x and 1x for EM mode and between 1x and 5x for non-EM mode
  • air (-65ºC) and water (-80ºC) cooling
  • 16 bits imaging

 

 

 

  1. Integrated touch screen to control all functions

  2. CoolLed pE300 ULTRA illumination

  3. Autofocus Leica AFC (Adaptive Focus Control)

  4. Fluorescence cubes:

     

Type

Dye

Excitation filter

Dichro

Emission filter

LED 405

DAPI, BFP

405/60

455

470/40

FITC/TXR

CFP, GFP

mCherry

455/50

560/40

495

595

520/40

635/65

 

  • Objectives:

Type

Magnification/N.A.

Immersion

Coverslip (mm)

Techniques *

HC PL Fluotar

5x/0.15

 

 

BF, Pol, DIC, FLUO

HC PL Fluotar

10x/0.32

 

0.17

BF, Pol, DIC, FLUO

HC PL Fluotar

20X/0.55

 

0.17

BF, Pol, DIC, FLUO

HC PL Fluotar

40x/0.80

 

0.17

BF, Pol, DIC, FLUO

HC PL APO

63X/1,40

oil

0.17

BF, FLUO


*BF = bright field, DIC = differential interference contrast, Pol = polarisation, FLUO = fluorescence

 

XY motorized stage:

  1. max. speed: 120 mm/s

  2. range: 130 x 85 mm

  3. resolution: 0,05 µm

Z motorized stage:
  1. step: 10 nm
  2. range: 12 mm
  3. four speeds: 2 coarse, 2 fine

Features:

  1. CMOS sensor FL-400
  2. effective number of pixels: 2048 x 2048
  3. effective area: 13,312 mm x 13,312 mm
  4. frame rate: 30 frames/s a máxima resolución
  5. quantum yield (QY): over 70% at 600 nm
  6. digital binning 2x2 / 4x4

 

  1. touch screen to control all functions

  2. metal halide lamp (120 W)

 

Fluorescence cubes:

Type

Excitation light

Excitation filter

Emission filter

DAPI

UV

356

BP 455/50

GFP

blue

BP 470/40

BP 525/50

DsRed

green

BP 530-585

LP 615

 

 
Objectives:

Type

Magnification/numerical aperture

Technique*

Inmersión

Plan-Apochromat

10x/0.45

BF,FLUO

 

Plan-Apochromat

25x/0.80

BF,DIC,FLUO

water, glycerol, oil

W N-Achroplan

40x/0.75

BF, FLUO

water

Plan-Apochromat

40X/1.2

BF,DIC,FLUO

water, glycerol, oil

Plan-Apochromat

63x/1.4

BF,DIC,FLUO

oil

 

*BF = bright field, DIC = differential interference contrast, FLUO = fluorescence

 

CCD camera Axiocam 503 colour
  1. pixels: 1936 x 1460
  2. pixel size: 4.54 μm x 4.54 μm
Confocal module

 

Lasers

  1. 405, 488, 458, 514, 561 and 633 nm

Detectors

  1. 3 spectral PMTs
  2. Airyscan detector for super-resolution
  3. 1 PMT for transmitted light

Motorized XY scanning stage

  1. speed: 100 mm/s
  2. resolution: 0,1 µm
  3. reproducibility

Motorized Z stage

  1. range: 500 μm
  2. speed: 5 mm/sec
  3. reproducibility: +/- 5 nm

Software

  1. ZEN black: image acquisition
  2. ZEN blue: image processing (3D, colocalisation)


Luminometer to perform screenings of immunofluorescence experiments (single or double labels), in order to select fluorescence-positive samples for subsequent observation and analysis on the confocal microscope.


Specifications:

 

  1. Fluorescence and Luminescence..
  2. FRET, TR-FRET and BRET.
  3. Excitation length range: 200-1000 nm
  4. Emission length range: 270-840 nm
  5. Microplates from 6 to 384 wells.
  6. Orbital shaking.
  7. Temperature control from 4 to 45°C.