INMUNIDAD INNATA DE LAS PLATAS Y RESISTENCIA A HONGOS NECRÓTROFOS

Personal:

El interés del grupo se centra en la caracterización de las bases moleculares y genéticas de la resistencia de las plantas a hongos necrótrofos, un grupo de agentes patógenos causantes de enfermedades devastadoras en muchos cultivos. Utilizamos como modelo de pato-sistema la interacción entre Arabidopsis thaliana y el hongo ascomiceto Plectosphaerella cucumerina, un patógeno que coloniza las plantas de Arabidopsis en sus hábitats naturales. El objetivo principal de nuestro grupo es la comprensión de cómo las plantas detectan este tipo de patógenos y activan la respuesta inmune para conferir resistencia mejorada a enfermedades, la cual implica la activación de varias vías de señalización defensivas. En paralelo, el grupo está tratando de descifrar los mecanismos moleculares de virulencia y patogenicidad de P. cucumerina. Varios aislados de P. cucumerina con diferentes estilos de vida en las plantas de Arabidopsis (por ejemplo patógeno, no patógeno y endofítico) han sido caracterizados y sus genomas han sido secuenciados y anotados. Utilizando estudios de genómica comparativa y evolutiva hemos identificado determinantes del hongo que explican las interacciones diferenciales de estas cepas críticas con las plantas de Arabidopsis. El grupo estudia además cómo la planta determina su  microbiota fúngica endofítica en los hábitats naturales y si este tipo de hongos regula positivamente la fisiología vegetal y el bienestar de la planta. (Factores ecológicos y moleculares implicados en el endofitismo y la patogénesis de hongos).

Las principales líneas de investigación del grupo son:

1) Respuestas de inmunidad innata y resistencia a hongos necrótrofos en Arabidopsis: reconocimiento del hongo y regulación de la respuesta inmunitaria.

La resistencia de Arabidopsis a hongos necrotrótrofos es compleja y depende de la interacción de las diferentes vías de señalización (Figura 1), tales como las mediadas por hormonas defensivas como etileno, ácido jasmónico y ácido salicílico, pero también ácido abscísico y auxinas (Llorente et al., 2008 ; Hernández-Blanco et al., 2007;. Berrocal-Lobo et al., 2008;. Berrocal-Lobo et al., 2002 Sánchez-Vallet et al., 2012; Denance et al., 2013). También hemos demostrado que la resistencia de no-huésped, metabolitos secundarios derivados del metabolismo del triptófano y péptidos antimicrobianos (APs) juegan un papel clave en la resistencia de las plantas a necrótrofos (Lipka et al., 2005; Stein et al., 2006; Bednarek et al. 2009; Sánchez-Vallet et al., 2010; Frerigmann et al., 2016;. Denancé et al., 2013; Harris et al, 2014; Yeung et al, 2016).

Figure 1.Signalling pathways and molecular mechanisms regulating immune response and resistance to necrotrophic fungi.

 

El grupo está especialmente interesado en descifrar cómo las plantas reconocen a P. cucumerina y activan la respuesta inmune. Las plantas poseen un sistema celular de control autónomo que comprende una colección de Receptores de Reconocimiento de Patrones (Pattern Reconginition Receptors, PRRs), tales como Quinasas Tipo Receptor (Receptor Like Kinases, RLKs) y Proteínas Tipo Receptor (Recpetor-Like Proteins, RLP), que, tras la percepción del patógeno, activan respuestas de inmunidad tempranas tales como la entrada de Ca+2 , la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS), cascadas de fosforilación de proteínas quinasas y cambios en la expresión génica. Nuestro grupo ha identificado varios componentes genéticos que controlan estas respuestas inmunitarias, como la RLK ERECTA (ER) o la proteína G heterotrimérica (Llorente et al., 2005). ER, además de controlar la resistencia a P. cucumerina y otros patógenos, regula diversos procesos de desarrollo, como la formación de estomas, la forma de órganos laterales y la arquitectura general de la planta (Llorente et al., 2005; Sánchez-Rodríguez et al., 2009). ER regula estos procesos de desarrollo mediante la interacción con la familia de parálogos de ER (ERf) Erecta-Like 1 (ERL1) y ERL2, la RLP Too Many Mouths (TMM) y Somatic Embryogenesis RLKs (incluyendo la proteína BAK1). Nuestros recientes resultados indican que este receptoroma multiproteíco formado por ERfs, TMM y BAK1 también modula la resistencia de Arabidopsis thaliana a PcBMM (Figura 2) Sorprendentemente, los péptidos secretados del tipo Factores de Patrón Epidérmico (Epidermal Pattern Factor 1 -EPF1- y EPF2), que son percibidos por ERfs, no regulan la respuesta inmune mediada por ER, lo cual sugiere que las señales subyacentes a las respuestas inmunes mediadas por BAK1-FER/TMM son distintos de las que regulan el patrón de formación de los estomas (Jordá et al., 2016).

Figure 2. Model of ERFs/TMM and BAK1 function in the regulation of immunityand development processes. The ERFs/TMM/BAK1 putative complex (orange box) regulates immunity and developmental processes through the recognition of unknown DAMPs/MAPMPs and EPFs peptides, respectively. Ligan binding activates MAPK cascades probably involving the YDA-MKK4/5-MPK3/6 module, and downstream effectors will lead to different cellular responses. Additional RLPs and RLKs might be requiered for the activity of the complex in immuniy and development processes. The dotted lines indicated uncharacterised genetic or biochemical interactions

 

Hemos identificado elementos genéticos específicos de la inmunidad mediada por ER, tales como una MAP3K que funciona en Arabidopsis aguas abajo de ER. Esta MAP3K es un regulador clave de una nueva vía inmunológica no canónica cuya activación constitutiva (CA-MAP3K) da lugar a una resistencia de amplio espectro a enfermedades causadas por diferentes tipos de patógenos, incluyendo hongos, oomicetos y bacterias con diferentes estilos de vida (Sopena et al., submitted). Plantas CA-MAP3K expresan de manera constitutiva genes de defensa que son inducidos después de la infección de la planta con diferentes tipos de patógenos y muestran alteraciones en su composición/estructura de la pared celular (Sopena-Torres et al., submitted).

Figure 3. Response of pD::LUC (promoter of RbohD , pD) and pF::LUC (promoter of RbohF, pF) transgenic lines to inoculation with pathogenic (PcBMM) or non-pathogenic (non-adaptaded, Pc2127) isolates of P. cucumerina fungus. The hours postinoculation (hpi) are indicated.

 

La proteína G heterotrimérica ha sido reconocida como un importante mediador de la inmunidad en Arabidopsis frente a diferentes patógenos, destacando muy especialmente la subunidad β (AGB1) y los dos subunidades g ( AGG1 y AGG2; Delgado-Cerezo et al. , 2012; Jiang et al., 2012; Trusov et al., 2010). Estas subunidades interaccionan con componentes genéticos adicionales que podrían modular diferentes respuestas de las plantas, tales como la integridad/estructura de la pared celular (Klopffleisch et al, 2011; Jiang et al , 2012; Delgado et al, 2013 ) o la producción de ROS (Torres et al., 2013; . Morales et al, 2016 ; Figura 3). Además, en un cribadode supresores de la susceptibilidad de agb1 a P. cucumerina, hemos identificado nuevos componentes (sgb9 -sgb13) de la vía de señalización mediada por AGB1. La caracterización funcional de estos mutantes sgb sugiere que AGB1 regula una red de regulación compleja y que respuestas inmunes no caracterizadas previamente son activadas en las plantas sgb.

2) SignWALLing: integridad de la pared celular y señales derivadas que regulan las respuestas inmunitarias de la planta.

La pared celular de la planta es una estructura compleja constantemente sometida a remodelación dinámica en respuesta a estímulos internos y a restricciones externas. La adaptación de la pared a estas señales del desarrollo y del medio ambiente está regulada por un sistema específico de control de la integridad de la pared celular vegetal (Cell-Wall Integrity, CWI) que inicia respuestas compensatorias para restaurar la integridad de la pared. Este sistema de CWI consiste en un conjunto de sensores/receptores que se unen específicamente a ligandos derivados de pared, los llamados patrones moleculares asociados a daño (Damage-Associated Molecular Patterns, DAMPs) que se liberan ante la alteración de la integridad de la pared. Este sistema de vigilancia de la planta funciona de la misma manera durante la infección por patógenos, dado que los microbios, para favorecer la colonización, modifican la composición de la pared por medio de enzimas secretados que degradan la pared celular. Así, es la percepción de DAMPs derivados de la pared o de moléculas microbianas (los llamados Patrones Moleculares Asociados a Patógenos, Pathogen-Associated Molecular Patterns, PAMPS) por PRRs específicos la que activa las respuestas inmunes (Miedes et al., 2013; Sánchez-Rodríguez et al., 2010).

Hemos identificado varios mutantes de Arabidopsis afectados en la pared celular (por ejemplo ern1/irx1/lew2 afectado en AtCESA8 necesario para la síntesis de celulosa de la pared celular secundaria) que muestran resistencia de amplio espectro a patógenos y a sequía. Esta resistencia a estreses se basa en nuevos mecanismos que implican la señalización mediante ABA y la acumulación de metabolitos secundarios y APs (Hernández-Blanco et al., 2007; Sánchez-Vallet et al., 2010). En línea con esta función de la pared celular vegetal en inmunidad, se encontró que el mutante er muestra alteraciones de la pared celular en comparación con plantas silvestres, alteraciones que se restauraron parcialmente al fenotipo silvestre en presencia de mutaciones supresoras de er (ser). Estos resultados sugieren que ER desempeña un papel regulador de la resistencia a patógenos mediada por alteraciones en la pared celular que es distinto de su papel en el desarrollo de la planta (Sánchez-Rodriguez et al., 2009). Del mismo modo, los mutantes mpk3 muestran alteraciones en la pared celular muy similares a las que presentan plantas er, que se restauran a fenotipos silvestres por la sobreexpresión de MAP3K (Sopena et al., to be submitted). Por otra parte, también la proteína G heterotrimeric de Arabidopsis ha sido implicada en la regulación de la integridad de la pared (Delgado-Cerezo et al., 2012;. Torres et al., 2013).

Para explorar este efecto regulador de la pared celular, hemos realizado un análisis detallado de la resistencia a diferentes agentes patógenos en una colección de mutantes de Arabidopsis afectados en pared celular primaria y secundaria. En este cribado parcial, un número significativamente alto de mutantes de pared celular (cwm) mostró alteradas la susceptibilidad/resistencia a uno o más patógenos en comparación con las plantas silvestres (Miedes et al., en preparación). La resistencia y los fenotipos de desarrollo de la colección de cwm , junto con la composición bioquímica de la pared celular, han sido integrados matemáticamente para construir un modelo predictivo que correlaciona cambios en los epítopos específicos de la pared con fenotipos de resistencia/crecimiento. Este modelo sugiere que la modulación de la integridad de la pared podría ser una estrategia eficaz para mejorar la resistencia de las plantas a amenazas ambientales y para obtener variedades de cultivos con resistencia mejorada a estreses tanto bióticos como abióticos (Miedes et al., 2014; Miedes et al., en preparación).

3) Genómica funcional del hongo necrótrofo Plectosphaerella cucumerina

Con el fin de profundizar en el conocimiento de cómo se defienden las plantas frente al ataque de patógenos es crucial caracterizar los mecanismos de colonización por parte los patógenos. El grupo ha establecido el pato-sistema P. cucumerina/Arabidopsis como modelo para estudiar las bases genéticas y moleculares de patogenicidad de hongos necrótrofos. Así, varias herramientas moleculares se han establecido para estudiar la colonización fúngica (Ramos et al., 2013 and 2015). Tres aislados de P. cucumerina que difieren en el estilo de vida y en la interacción con Arabidopsis han sido caracterizados (Figura 4): PcBMM es un aislado completamente patogénico que coloniza Arabidopsis causando extensas necrosis; Pc2127 no causa necrosis ni coloniza las plantas de Arabidopsis de silvestre, aunque infecta mutantes de Arabidopsis inmunodeficientes (cyp79b2 cyp79b3); Pc0831 es un aislado endofítico identificado en poblaciones silvestres de Arabidopsis que no causa daño a la planta (Sánchez-Vallet et al., 2010; Ramos et al., 2013;. García et al., 2013;. Muñoz et al., en preparación). Los genomas de estos tres aislados han sido secuenciados y anotados y se están realizando actualmente análisis de genómica comparativa y evolutiva para identificar los determinantes fúngicos que expliquen las diferentes interacciones de estos aislados con las plantas de Arabidopsis (Muñoz et al., en preparación). Estudios similares han sido realizados con la interacción entre el endófito fúngico Colletotrichum tofieldiae y Arabidopsis, revelando que características genómicas y transcriptómicas específicas están relacionadas con las respuestas beneficiosas de este aislado mutualista (Hacquard et al., 2016;. Hiruma et al., 2016). Ambos aislados endofíticos de Colletrichum y Plectosphaerella han sido obtenidos por nuestro grupo de poblaciones naturales de Arabidopsis thaliana dentro de la línea de investigación "Factores ecológicos y moleculares implicados en el endofitismo de hongos y su patogénesis" (Factores ecológicos y moleculares implicados en el endofitismo y la patogénesis de hongos). En esta línea de investigación, estudiamos cómo las plantas determinan su microbiota fúngica endofítica en los hábitats naturales y si este tipo de hongos regula positivamente la fisiología y el bienestar de las plantas.

Figure 4. A. Disease symptoms in wild-type plants (Col-o) and the immune deficient mutant cyp79b2b3 at 7 days postinoculation with either a pathogenic (PcBMM), a non-pathogenic (Pc2127) or and edophytic (Pc0831) isolate of P. cucumerina fungus. The control plants (Mock) were treated with water. B. Confocal microscopy images if wild-type plants (Col-0) and the immune deficient mutant agb1-1 at 24 hours after inoculation with PcBMM-GFP and Pc2127-GFP transformants constitutively expressing GFP.

 

Publicaciones

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